Okna do mikrosvěta

Na lovu neviditelného

"Spatřil jsem neuvěřitelné množství zvířátek plavajících čiperněji než cokoli, co jsem do té doby viděl. Největší z nich kroutila svými tělíčky a tak se pohybovala vpřed. A co víc - menších zvířátek bylo tolik, že voda vypadala jako živá."
Citát pochází z dopisu, který roku 1674 zaslal Královské společnosti v Londýně holandský obchodník s látkami, výrobce mikroskopů a amatérský pozorovatel mikrosvěta Antoni van Leeuwenhoek. Jedná se o jeden z nejstarších záznamů o pozorování bakterií. Leeuwenhoek je objevil v povlaku na zubech starce, jenž si svůj chrup nikdy v životě nečistil. Holandský badatel se ovšem musel smířit s tím, že ani řádná ústní hygiena mikroskopické živáčky zcela neodstraní. Na vlastních zubech "zvířátka" objevil také. Jen jich bylo o poznání méně.

JEDINÁ ČOČKA

Leeuwenhoekovy přístroje byly nesmírně jednoduché, přesto ve své době neměly konkurenci. Dnešní mikroskopy nepřipomínaly ani v nejmenším. Jejich optickou
část tvořila jediná čočka zasazená do mosazné destičky, vzorek se umisťoval na hrot před čočku a jeho pozice se dala nastavit dvojicí šroubů. Mikroskop se držel v ruce těsně u oka. Zatímco složitější přístroje ostatních konstruktérů dosahovaly s bídou padesátinásobného zvětšení, Leeuwenhoekovy mikroskopy zvětšovaly až 270x a jejich rozlišení bylo až 1,35 mm (tisícin milimetru). Právě to jejich tvůrci umožnilo spatřit do té doby neviděné. Zkoumal snad vše, co bylo možno umístit pod mikroskop - hmyz, krev, zubní povlak, jezerní vodu... Pozoroval bakterie, prvoky, spermie, krvinky, mikroskopické hlísty, vířníky. Tok krve v kapilárách úhoře dokonce roku 1698 osobně demonstroval ruskému carovi Petru Velikému.

OD JANSSENA K ZEISSOVI

Anthoni van Leeuwenhoek nebyl první výrobce mikroskopů. Už kolem roku 1595 vznikl v dílně Holanďana Zachariase Janssena přístroj tvořený dvěma čočkami umístěnými na opačných koncích posuvného tubusu. Při maximálním roztažení byl dlouhý 1,2 metru, zvětšoval pouze devětkrát a trpěl vážnými optickými vadami. Okolo pozorovaných objektů se tvořilo barevné halo. Mikroskopy Angličana Roberta Hooka z roku 1665 byly sice silnější, i ony však měly potíže s kvalitou zobrazení. Tehdejší úroveň optiky zkrátka ještě neumožňovala konstrukci kvalitních mikroskopů složených z více čoček. Hooke bývá někdy označován za objevitele buněk. Ne zcela zaslouženě. V plátcích korku je sice pozoroval, jenomže netušil, že sleduje základní stavební kameny všech živých těl; považoval je za pouhé kanálky pro cirkulaci tekutin. Optické vady složených mikroskopů byly odstraněny až v 19. století. Výrazné zvýšení kvality přístrojů šlo ruku v ruce s bouřlivým rozvojem věd na mikroskopu závislých, zvláště biologie a medicíny. Světový věhlas si v té době získala firma Zeiss, vyrábějící optické přístroje dodnes. Sešli se v ní tři špičkoví odborníci: jemný mechanik a optik Carl Zeiss, chemik Otto Schott, který vylepšil optické vlastnosti skla, a fyzik Ernst Abbe, jenž pracoval na teoretických principech optiky.

OPTICKÉ TRIKY

Základní princip optického mikroskopu se od 19. století nezměnil, už v dobách Carla Zeisse narazil na nepřekonatelné hranice dané fyzikálními zákony - zvětšení maximálně 2000x a rozlišení 0,2 mm. Byly však vyvinuty mnohé metody, které značně rozšířily možnosti badatelů. Aby se např. světelným paprskům usnadnila cesta skrz vzorek do objektivu, používá se u větších zvětšení tzv. imerze - mezi krycím sklíčkem a objektivem není vzduch, ale např. speciální olej, který má stejný index lomu jako sklo. Světlo tak nemusí "přestupovat" z jednoho prostředí do druhého a do objektivu ho pronikne výrazně více. Vědci se postupně naučili vzorky barvit různými barvivy, která se vážou pouze na určitý typ látek, např. jen na některé buněčné organely, a tím zvyšují jejich viditelnost. Zvýraznit rozdíly ve zdánlivě zcela průhledném vzorku však lze i bez barvení. Stačí vhodně využít optických vlastností světla. Pozorování v temném poli nebo v polarizovaném světle, Nomarského diferenciální kontrast (viz rámeček), metoda fázového kontrastu, která umí využít rozdíly v rychlosti, jakou světlo proniká vzorkem, ke zvýraznění kontrastu - to jsou jen některé z řady optických triků, jimiž vědci dokážou zviditelnit neviditelné.

POSVÍTÍME SI NA TEBE!

Významnou novinku přinesl nápad využít při pozorování mikroskopických objektů fluorescenci. Co to je? Některé látky mají zajímavou vlastnost - když na ně posvítíte světlem o určité vlnové délce, energie tohoto světla zapůsobí na elektrony v jejich atomech a vymrští je na energeticky bohatší oběžné dráhy kolem atomových jader. Když se potom elektrony vracejí zpět ke své obvyklé, ospalé existenci, uvolní energii ve formě záření o jiné, delší vlnové délce, než jakou mělo záření, které celý poprask způsobilo. Jinými slovy: látka se rozsvítí. Fluorescenční mikroskopy, sériově vyráběné od 70. let 20. století, využívají tento princip k získání unikátních obrázků. Na vzorek se posvítí zářením o takové vlnové délce, která dokáže vyvolat fluorescenci některé z látek ve vzorku. Takto "vyrobené" světlo je zachyceno detektorem a vytváří obraz pozorovaného objektu. Zbytkové původní záření je odfiltrováno, na vzniku obrazu se nepodílí. Oblasti vzorku, v nichž ke fluorescenci nedošlo, proto zůstanou tmavé.

ZÁŘÍCÍ VZORKY

Schopnost vydávat po "polechtání" jiným zářením vlastní světlo mají i mnohé přírodní látky, např. chlorofyl nebo některé vitaminy se rozsvítí pod vlivem UV záření. Jiným látkám musíme pomoci. Ke slovu přicházejí fluorochromy - sloučeniny schopné fluorescence. Navážou se na některou látku ve vzorku, např. na DNA, a tím ji zviditelní. V mikroskopu pozorujeme vlastně pouze fluorochrom, který se však nachází jedině tam, kde je i námi zkoumaná látka. K čemu je takové hraní dobré? Protože pozorovaný obraz je vytvářen pouze světlem vyzářeným sledovanou látkou, neruší nás nic dalšího. Můžeme studovat např. chromozomy, bílkoviny tvořící buněčnou kostru nebo organely, které bychom jinak nebyli schopni odhalit. Viditelné jsou i objekty tak malé, že je v běžném mikroskopu spatřit nelze, třeba dvoušroubovice DNA, jejíž průměr je stokrát menší než rozlišovací schopnost optického mikroskopu. Zviditelní ji až množství molekul barviva, které se na ni navážou. Můžeme použít více fluorochromů zároveň. Vzorek potom ozařujeme různými vlnovými délkami, aby se postupně rozsvítily všechny látky, které nás zajímají. Jednotlivé obrázky je možno v počítači složit a získat vícebarevný obraz, dávající představu o vzájemných vztazích uvnitř zkoumaného objektu, např. buňky nebo tkáně.

PŘESNĚ MÍŘENÉ LASERY

Ve druhé polovině 80. let se v laboratořích začaly objevovat tzv. konfokální mikroskopy, využívající fluorescence ještě dokonaleji. Běžné fluorescenční mikroskopy se potýkají s nepříjemným problémem: na detektor dopadá i světlo vyzářené z vrstev vzorku ležících nad a pod rovinou ostrosti. Konfokální mikroskop tento "světelný šum" odstraňuje. Světlo z vrstev, které nás v danou chvíli nezajímají, je z dráhy vedoucí k detektoru odstraněno. V cestě mu stojí zábrana s miniaturním otvorem, jenž propustí pouze světlo z právě zkoumaného místa. Výsledkem je perfektně ostrý obraz. Zdrojem světla vyvolávajícího fluorescenci vzorku je u konfokálního mikroskopu laser, jehož paprsek míří v každém okamžiku pouze do jediného místa. Paprsek se obrovskou rychlostí bod po bodu posouvá, takže postupně osvítí celý vzorek. Údaje získané z jednotlivých bodů se nakonec v počítači složí do úplného obrazu.

VIRTUÁLNÍ ŘEZY

Laserový paprsek potom můžeme zaměřit do jiné hloubky a postupně pořídit obraz z dalších a dalších vrstev vzorku. Mikroskop tak vytváří "optické řezy" - jako by vzorek rozřezal na tenoulinké plátky. Kdybychom jich na sebe poskládali tisíc, byly by vysoké pouhou polovinu milimetru. Počítačovým zpracováním řezů lze vytvořit trojrozměrné modely zkoumaných struktur nebo animaci procházející vzorkem od povrchu až do hloubky několika desetin milimetru. Konfokální mikroskop je nesmírně citlivý, pro získání obrazu je tedy zapotřebí malé množství barviv. To je důležité pro pozorování živých buněk, protože těm barvení příliš nesvědčí. Nabízí se tak fantastická možnost sledovat procesy v živých tkáních, např. změny koncentrace určité látky v prostoru a čase. Antoni van Leeuwenhoek by se asi divil, v jak důmyslné zařízení se proměnil přístroj, který v jeho provedení sestával z jediné čočky.


JEDINÝ U NÁS
Letos v lednu byl slavnostně zahájen provoz konfokálního mikroskopu (na obr.), který si společně pořídily čtyři vědecké ústavy Akademie věd: Fyziologický ústav, Ústav experimentální medicíny, Mikrobiologický ústav a Ústav experimentální botaniky. Čtyři ústavy na jeden mikroskop? Nedivte se. "Hračka" s dlouhým jménem Leica TCS SP2 AOBS stála 13,5 milionu Kč, což není zrovna málo. Však se také jedná o přístroj představující současnou technologickou špičku, druhý takový v ČR nenajdete. Je ještě výkonnější než starší typy, řada vylepšení posunula možnosti vědců zase o kus dál.

FALEŠNÝ TŘETÍ ROZMĚR
Mezi optické triky důmyslně využívající vlastnosti světla patří i Nomarského diferenciální kontrast, zvyšující rozdíly v jasu mezi různými částmi vzorku. Pracuje s polarizovaným světlem, které se na dvojlomných hranolech dělí na dva nepatrně posunuté obrazy. Výsledek působí dojmem šikmo osvětleného trojrozměrného objektu. Snímky řas a sinic z našich přehrad pořídil touto metodou v mikroskopu Olympus BX 51 Petr Znachor. Na prvním snímku je koloniální sinice Gloeotrichia, na druhém kolonie zelené řasy Eudorina ve slizovém obalu a vláknitá sinice Anabaena.

VIDÍ, MĚŘÍ, POČÍTÁ
V minulosti měl výzkumník velmi omezené možnosti. Důležité objevy mohl překreslit nebo vyfotografovat, případně pomocí měřicí vložky v okuláru určit rozměry pozorovaných objektů. Preparát mohl zabezpečit proti vyschnutí a uschovat, ale nic víc. Dnešní mikroskopy propojené s počítači umožňují nejen pohodlnou archivaci obrázků, ale i jejich podrobnou analýzu. Měření, výpočty buněčných objemů a koncentrací barevně odlišených látek, tvorba trojrozměrných modelů, skládání více obrázků do sebe... Dříve nemyslitelné je dnes samozřejmostí.

MÍSTO SVĚTLA ELEKTRONY
Chybí vám v článku zmínka o elektronových mikroskopech? Máte pravdu, zapomenout na ně nelze. Vždyť transmisní elektronový mikroskop nám umožnil dohlédnout až na úroveň atomů, skanovací mikroskop zase poskytuje detailní snímky s neuvěřitelnou hloubkou ostrosti - i velmi členité objekty umí zobrazit naprosto věrně. Samostatný článek o těchto přístrojích najdete v některém z příštích čísel tohoto ročníku ABC.